ECHO在DNA組裝中的應用
日期：2025-04-21 06:02
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摘要：ECHO在DNA組裝中的應用，使用Agilent 2200 TapeStation 分析DNA 濃度，并將DNA稀釋至組裝所需濃度。然后，將稀釋好的DNA轉(zhuǎn)移至經(jīng)Echo驗證過的低死體積384微孔板（384 LDV Plus）。另外將NEBuilder HiFi 2x Master Mix 分裝入384 LDV Plus板。對于復雜組裝，NEBuilder HiFi 試劑盒的建議組裝體積為 20 uL，每個片段的加入量為 0.5 pmol。根據(jù)以往echo結(jié)果， 500 nL 反應體系（每個片段1.25 fmol）具有高穩(wěn)定性。按照該條件完成體系構(gòu)建和封膜后，于Applied Biosystems ProFlex PCR 50°C孵育1小時。待PCR反應板冷卻至4°C后轉(zhuǎn)化到 NEB 10B 大腸桿菌細胞中。之后進行轉(zhuǎn)化/質(zhì)粒構(gòu)建，大腸桿菌鋪板。
ECHO在DNA組裝中的應用
磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亞基ɑ（PIK3CA）是一個被廣泛研究的基因， 鑒于PIK3CA在癌癥研究中的重要性，我們將以它為例來展示Echo 525系統(tǒng)驅(qū)動的微量化NEBuilder HiFi試劑盒應用。根據(jù)目標結(jié)構(gòu)域，PIK3CA被拆分為四個模塊化片段7，并帶上C末端GLP標簽。在模塊化片段中設計了四個已知的致癌突變 —— R38H、 E542K、E545K和H1047R，同時我們也設計了一個野生型對照。（如下圖）。
DNA組裝
為更真實地模擬實際應用中面臨的挑戰(zhàn)，我們對該微量化反應體積的模塊化DNA組裝進行了構(gòu)建設計。選擇PIK3CA 癌基因，并根據(jù)結(jié)構(gòu)域?qū)⑵浞譃樗膫€片段。這些片段或為野生型序列或含有已知致癌突變R38H、E542K、E545K和H1047R。這些片段將**入線性化的 pcDNA?3.1/Zeo (+) 哺乳細胞載體中。該Kpnl-HF酶切的載體被稱為片段 5。所有片段從IDT公司定制（gBIocks®基因片段），其末端均帶有 23-25 個堿基對的重疊區(qū)。隨后，進行PCR擴增載體和gBIocks，以獲得實驗所需用量。在進行了載體DNA組件生產(chǎn)（pcDNA?3.1/Zeo (+) 片段5）后進行DNA純化、定量分析和電泳觀察（片段1-5）。
DNA和NEBuilder HiFi
Master Mix 陣列
使用Agilent 2200 TapeStation 分析DNA 濃度，并將DNA稀釋至組裝所需濃度。然后，將稀釋好的DNA轉(zhuǎn)移至經(jīng)Echo驗證過的低死體積384微孔板（384 LDV Plus）。另外將NEBuilder HiFi 2x Master Mix 分裝入384 LDV Plus板。對于復雜組裝，NEBuilder HiFi 試劑盒的建議組裝體積為 20 uL，每個片段的加入量為 0.5 pmol。根據(jù)以往echo結(jié)果， 500 nL 反應體系（每個片段1.25 fmol）具有高穩(wěn)定性。按照該條件完成體系構(gòu)建和封膜后，于Applied Biosystems ProFlex PCR 50°C孵育1小時。待PCR反應板冷卻至4°C后轉(zhuǎn)化到 NEB 10B 大腸桿菌細胞中。之后進行轉(zhuǎn)化/質(zhì)粒構(gòu)建，大腸桿菌鋪板。
gBLOCK® 擴增引物
模塊化 DNA 組裝所使用的試劑體積。這些試劑全部通過 Echo 525 從 384 LDV Plus 板上進行移液。
菌落qPCR質(zhì)控
針對組裝質(zhì)粒構(gòu)建物的4個不同連接區(qū)，Echo 525 移液器可**地將 250 nL 的細胞懸液分滴至4個10 uL qPCR反應體系中，作為質(zhì)粒組裝的一種質(zhì)控方式。對于4種反應，分別配制含有擴增子引物對和 LightCycler® 480 SYBR Green I Maser 核酸染料的qPCR反應母液。首先將母液分裝到帶條形碼的 Bio-Rad Hard-Shell* Skirted 384孔PCR 板中，1000 x g離心1分鐘。隨后，采用P10槍頭挑選單克隆到Echo Qualified 384 孔聚丙烯微孔板 2.0 （384孔PP板）中，接種在 50 uL diH20。對裝有細胞的384孔 PP 板封膜，置于Eppendorf MixMate® 2000 RPM 2分鐘渦旋震蕩。從該混合物中，使用Echo校準 384PP_AQ_BP，將 250 nL 的細胞懸液噴射到384孔PCR 板的相應qPCR反應母液中。然后，光學薄膜密封qPCR板， 2000 RPM渦旋震蕩2分鐘， 1000 x g 離心1分鐘。接下來，根據(jù)表7中實驗條件進行菌落qPCR檢測。同時具有3個連接取qPCR cp值（與氨芐青霉素對照匹配）的菌落被認為是陽性組裝物，將對其進行高通量測序。
菌落qPCR反應體積
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利用更小規(guī)模的DNA組裝方法能夠減少合成生物學研究成本，加速實驗設計、構(gòu)建、測試的過程。在本次實驗中，NEBuilder HiFi利用ECHO 525每次移液25納升進行致癌基因的五個模塊片段的組裝。與NEBuilder HiFi試劑盒的建議量相比，使用ECHO 525進行組裝減小了40倍的反應體系。按照40倍減少的反應計算，500納升的反應體系只需要1.25fmol DNA。我們可以看到，使用ECHO 525能夠以低成本的反應體系獲得高質(zhì)量的DNA構(gòu)建，減少DNA組裝成本，擴展了基因工程的方法，為科學家探索更廣泛的生物學領(lǐng)域助力。
磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3激酶催化亞基ɑ（PIK3CA）是一個被廣泛研究的基因， 鑒于PIK3CA在癌癥研究中的重要性，我們將以它為例來展示Echo 525系統(tǒng)驅(qū)動的微量化NEBuilder HiFi試劑盒應用。根據(jù)目標結(jié)構(gòu)域，PIK3CA被拆分為四個模塊化片段7，并帶上C末端GLP標簽。在模塊化片段中設計了四個已知的致癌突變 —— R38H、 E542K、E545K和H1047R，同時我們也設計了一個野生型對照。（如下圖）。
DNA組裝
為更真實地模擬實際應用中面臨的挑戰(zhàn)，我們對該微量化反應體積的模塊化DNA組裝進行了構(gòu)建設計。選擇PIK3CA 癌基因，并根據(jù)結(jié)構(gòu)域?qū)⑵浞譃樗膫€片段。這些片段或為野生型序列或含有已知致癌突變R38H、E542K、E545K和H1047R。這些片段將**入線性化的 pcDNA?3.1/Zeo (+) 哺乳細胞載體中。該Kpnl-HF酶切的載體被稱為片段 5。所有片段從IDT公司定制（gBIocks®基因片段），其末端均帶有 23-25 個堿基對的重疊區(qū)。隨后，進行PCR擴增載體和gBIocks，以獲得實驗所需用量。在進行了載體DNA組件生產(chǎn)（pcDNA?3.1/Zeo (+) 片段5）后進行DNA純化、定量分析和電泳觀察（片段1-5）。
DNA和NEBuilder HiFi
Master Mix 陣列
使用Agilent 2200 TapeStation 分析DNA 濃度，并將DNA稀釋至組裝所需濃度。然后，將稀釋好的DNA轉(zhuǎn)移至經(jīng)Echo驗證過的低死體積384微孔板（384 LDV Plus）。另外將NEBuilder HiFi 2x Master Mix 分裝入384 LDV Plus板。對于復雜組裝，NEBuilder HiFi 試劑盒的建議組裝體積為 20 uL，每個片段的加入量為 0.5 pmol。根據(jù)以往echo結(jié)果， 500 nL 反應體系（每個片段1.25 fmol）具有高穩(wěn)定性。按照該條件完成體系構(gòu)建和封膜后，于Applied Biosystems ProFlex PCR 50°C孵育1小時。待PCR反應板冷卻至4°C后轉(zhuǎn)化到 NEB 10B 大腸桿菌細胞中。之后進行轉(zhuǎn)化/質(zhì)粒構(gòu)建，大腸桿菌鋪板。
gBLOCK® 擴增引物
模塊化 DNA 組裝所使用的試劑體積。這些試劑全部通過 Echo 525 從 384 LDV Plus 板上進行移液。
菌落qPCR質(zhì)控
針對組裝質(zhì)粒構(gòu)建物的4個不同連接區(qū)，Echo 525 移液器可**地將 250 nL 的細胞懸液分滴至4個10 uL qPCR反應體系中，作為質(zhì)粒組裝的一種質(zhì)控方式。對于4種反應，分別配制含有擴增子引物對和 LightCycler® 480 SYBR Green I Maser 核酸染料的qPCR反應母液。首先將母液分裝到帶條形碼的 Bio-Rad Hard-Shell* Skirted 384孔PCR 板中，1000 x g離心1分鐘。隨后，采用P10槍頭挑選單克隆到Echo Qualified 384 孔聚丙烯微孔板 2.0 （384孔PP板）中，接種在 50 uL diH20。對裝有細胞的384孔 PP 板封膜，置于Eppendorf MixMate® 2000 RPM 2分鐘渦旋震蕩。從該混合物中，使用Echo校準 384PP_AQ_BP，將 250 nL 的細胞懸液噴射到384孔PCR 板的相應qPCR反應母液中。然后，光學薄膜密封qPCR板， 2000 RPM渦旋震蕩2分鐘， 1000 x g 離心1分鐘。接下來，根據(jù)表7中實驗條件進行菌落qPCR檢測。同時具有3個連接取qPCR cp值（與氨芐青霉素對照匹配）的菌落被認為是陽性組裝物，將對其進行高通量測序。
菌落qPCR反應體積
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利用更小規(guī)模的DNA組裝方法能夠減少合成生物學研究成本，加速實驗設計、構(gòu)建、測試的過程。在本次實驗中，NEBuilder HiFi利用ECHO 525每次移液25納升進行致癌基因的五個模塊片段的組裝。與NEBuilder HiFi試劑盒的建議量相比，使用ECHO 525進行組裝減小了40倍的反應體系。按照40倍減少的反應計算，500納升的反應體系只需要1.25fmol DNA。我們可以看到，使用ECHO 525能夠以低成本的反應體系獲得高質(zhì)量的DNA構(gòu)建，減少DNA組裝成本，擴展了基因工程的方法，為科學家探索更廣泛的生物學領(lǐng)域助力。